اليوم: الخميس 28 مارس 2024 , الساعة: 9:36 م
لم يعلق احد حتى الآن .. كن اول من يعلق بالضغط هنا
اخر المشاهدات
- [ محلات أحذية الامارات ] هي اند شي لتجارة الاحذية # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ كيف تكون زاهدا في الدنياهكذا كان الصالحون - خالد عبد الرحمن الحسينان ] 3 - أن يستوي عند العبد حامده وذامه في الحق ، وهذا من علامات الزهد في الدنيا واحتقارها ، وقلة الرغبة فيها، فإن من عظمت الدنيا عنده أحب المدح وكره الذم ، فربما حمله ذلك على ترك كثير
- [ حكمــــــة ] عن ابن عباس رضي الله عنهما قال: يقول تعالى: لو أني أنزلت هذا القرآن على جبل حملته إياه تصدع وخشع من ثقله ومن خشية الله، فأمر الله عز وجل الناس إذا أنزل عليهم القرآن أن يأخذوه بالخشية الشديدة والتخشع فالعَجَبُ كل العَجَبِ من مُصَلٍّ عظمة غفل
- [ الخدمات و تخليص المعاملات قطر ] خليج العقبة للخدمات # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ فوائد الفواكه ] ما فوائد التفاح # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ تعرٌف على ] قائمة عارضات غلاف مجلة فوغ (النسخة الإيطالية) # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ حكمة بليغةهكذا كان الصالحون - خالد عبد الرحمن الحسينان ] قال شيخ الإسلام : فإن عظمة الله تعالى وجلاله في قلب العبد يقتضي تعظيم حرماته وتعظيم حرماته يحول بينه وبين الذنوب والمتجرئون على معاصيه ما قدروه حق قدره . # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ تعرٌف على ] ثريا اللمكية # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- تفسير رؤية الارنب في الحلم لابن سيرين وابن شاهين # اخر تحديث اليوم 2024-02-15
- [ سيارات السعودية ] ورشة الجرفين لسمكرة وبويات السيارات # اخر تحديث اليوم 2024-03-26
- [ الخدمات و تخليص المعاملات قطر ] مؤسسة البسام للعقارات وتخليص المعاملات # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ الغطاء النباتي ] الأهمية الاقتصادية للغابات الاستوائية المطيرة # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ وسطاء عقاريين السعودية ] موسى علي بن مردف سهلي ... الرياض ... منطقة الرياض # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ مستوصفات وعيادات السعودية ] مجمع الدكتور تركي الطبي العام # اخر تحديث اليوم 2024-03-27
- [ خذها قاعدة ] إنّ العالم ينفق كليّة طاقاته في مقولات ال(نعم) وال(لا) ضمن نقد ما فكر فيه غيره، أمّا هو فإنه لم يعد يفكر. - فريدريك نيتشه # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ تعرٌف على ] المعهد الثقافي الكردي في فيينا # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ خذها قاعدة ] ليتنا أنا وأنت جئنا العالم قبل اختراع التلفزيون والسينما , لنعرف هل هذا حب حقاً أم أننا نتقمص ما نراه. - أحمد خالد توفيق # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ تعرٌف على ] فيروس كورونا المرتبط بالمتلازمة التنفسية الحادة الشديدة # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ دليل دبي الامارات ] شركة تاوازون للكيماويات ذ.م.م اتش كيو ... دبي # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- أحداث حافلة فاس تفاصيل البطولة المغربية لموسم 72/73 في ظ±خر دورة # اخر تحديث اليوم 2024-02-23
- ما هي أعراض تهبيطة الرحم # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ خذها قاعدة ] حاولوا أن تطفئوا حرائق الجهل ثم تضيئوا أنوار العلم , هذا هو الداء والدواء. - جلال عامر_x000D_ # اخر تحديث اليوم 2024-03-27
- [ حبوب البشرة ] إزالة آثار حب الشباب في يومين # اخر تحديث اليوم 2024-03-27
- [ وسطاء عقاريين السعودية ] مؤسسة شموع تبوك للتطوير العقاري ... تبوك ... منطقة تبوك # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ خذها قاعدة ] أينما كان هناك مُجتمعٌ إنساني... تتجلى روح المسرح التي لا يمكن كبتها. - بريت بيلي # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ خذها قاعدة ] اذا فسدت البيئة فلابد للانسان أن يحتمي بعقله لينجو من الفساد. - أحمد زكي # اخر تحديث اليوم 2024-03-27
- تعرٌف على ... أسامة جاويش | مشاهير # اخر تحديث اليوم 2024-03-17
- [ محلات أحذية الامارات ] محل تصليح الاحذية # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ تعرٌف على ] ماكيماكي # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- رؤية طفل بعيون خضراء في المنام # اخر تحديث اليوم 2024-02-10
- [ مؤسسات البحرين ] شركة النيل المصرية العقارية ذ.م.م ... المحرق # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ وسطاء عقاريين السعودية ] صالح أحمد دخيل الزهراني ... جدة ... منطقة مكة المكرمة # اخر تحديث اليوم 2024-03-27
- [ وسطاء عقاريين السعودية ] وسيم مردعان يحي حكمي ... مزهره ... منطقة جازان # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ تعرٌف على ] ألفريد فيلهلم فولكمان # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ حكمــــــة ] إن الله أمرنا بالجدية في الإسلام فقال : \" إِنَّهُ لَقَوْلٌ فَصْلٌ وَمَا هُوَ بِالْهَزْلِ \" [ الطارق /13-14] فالأمر ليس هزلًا ، اليوم نرى سمات الصالحين في الظاهر ، ولكن على قلوب فارغة ، على عقول فارغة ، وأنا آسف إن قلت هذا ، ولكن هذا واقع لل
- [ تعرٌف على ] باز أحمر الذيل # اخر تحديث اليوم 2024-03-27
- [ تعرٌف على ] معركة الخالدية (2016) # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ شركات الازياء والموضة قطر ] لا سنزا ... الدوحة # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ فوائد الفواكه ] فوائد منقوع التين المجفف # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ حكمــــــة ] ما قيل في العلم والعلماء: عن وهب بن منبه رحمه الله قال: إن للعلم طغيانًا كطغيان المال. [الحلية (تهذيبه) 2 / 49]. # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ تعرٌف على ] دير الأنبا مقار # اخر تحديث اليوم 2024-03-27
- [ تعرٌف على ] الحروب النابليونية # اخر تحديث اليوم 2024-03-27
- [ تعرٌف على ] طب العيون العصبي # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ مواد البناء و التجارة قطر ] حكاية للتجارة والمقاولات وتخليص المعاملات # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ وسطاء عقاريين السعودية ] وائل محمد راشد المشدق ... جدة ... منطقة مكة المكرمة # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ دليل دبي الامارات ] المجلس الشعبي للمطابخ ذ م م ... دبي # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- تفسير حلم رؤية الميت يشكو من ضرسه في المنام # اخر تحديث اليوم 2024-02-11
- [ صيدليات الامارات ] عبد الله المطوع للصيدليات والكيماويات # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ شركات الازياء والموضة قطر ] برروما roopam textiles ... الدوحة # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ حكمــــــة ] قال الحسن : « باليقين طلبت الجنة ، وباليقين هرب من النار ، وباليقين أوتيت الفرائض ، وباليقين صبر على الحق ، وفي معافاة الله خير كثير قد والله رأيناهم يتقاربون في العافية فلما نزل البلاء تفارقوا ». # اخر تحديث اليوم 2024-03-27
- [رقم هاتف] الطبيب بوعلام عبد العزيز .. المغرب # اخر تحديث اليوم 2024-02-28
- [ متاجر السعودية ] مؤسسة ساس المتكاملة ... الرياض ... منطقة الرياض # اخر تحديث اليوم 2024-03-27
- [ وسطاء عقاريين السعودية ] محمد بن مطلق بن مطيران المزيني ... المدينه المنوره ... منطقة المدينة المنورة # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ دليل أبوظبي الامارات ] انرجى ستار للبتروكيماويات ذ م م ... أبوظبي # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ محلات أحذية الامارات ] Milano # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ وسطاء عقاريين السعودية ] هند حمدان رده الجابري ... الطائف ... منطقة مكة المكرمة # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ مؤسسات البحرين ] المجلس لمواد البناء ... منامة # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ مؤسسات البحرين ] صالون المجلس للحلاقه الرجاليه ... المنطقة الشمالية # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- عقار موبيتيل Mobitil لعلاج الروماتيزم # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- حملة الإحسان للحج والعمرة # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ تسوق وملابس الامارات ] غلامهيت للخياطة والتطريز ... دبي # اخر تحديث اليوم 2024-03-12
- [ شركات السياحة والسفر قطر ] خطوط الطيران العمانية OMAN AIR ... الدوحة # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ شركات مقاولات السعودية ] شركة أساس الكهروميكانيكا للمقاولات ... مكة المكرمة ... مكة المكرمة # اخر تحديث اليوم 2024-03-27
- [ وسطاء عقاريين السعودية ] عبدالرحيم بن غليث بن مسلم الرويتعي ... المدينه المنوره ... منطقة المدينة المنورة # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ تعرٌف على ] الثورات الكردية في تركيا # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ مؤسسات البحرين ] مغسلة المجلس ... المحرق # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ وسطاء عقاريين السعودية ] خالد مريع بن تركي القحطاني ... الدمام ... المنطقة الشرقية # اخر تحديث اليوم 2024-03-27
- [ وسطاء عقاريين السعودية ] عبدالرحمن عبدالله مرداس القحطاني ... الطائف ... منطقة مكة المكرمة # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ مؤسسات البحرين ] المجلس للأدوات الكهربائية ... المنطقة الشمالية # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ تعرٌف على ] اختراع الهاتف # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ حكمــــــة ] علامات الشقاوة: أنه كلما زيد في علمه زيد في كبره وتيهه . وكلما زيد في عمله زيد في فخره واحتقاره للناس وحسن ظنه بنفسه . وكلما زيد في عمره زيد في حرصه . وكلما زيد في ماله زيد في بخله وإمساكه . وكلما زيد في قدره وجاهه زيد في كبره وتيهه # اخر ت
- [ الخدمات و تخليص المعاملات قطر ] القطري للتجارة والمقاولات # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [رقم هاتف] شركة مزايا للاستيراد والتصدير .. بالاردن الهاشمية # اخر تحديث اليوم 2024-03-20
- [ خذها قاعدة ] من قال أن المال لايشتري السعادة لم يكن لديه ما يكفي من المال. - جان بول سارتر # اخر تحديث اليوم 2024-03-27
- - وكاله غاز سلواد # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- عبارات ترحيب قصيرة 40 من أجمل عبارات ترحيب للأحباب والأصدقاء 2021 # اخر تحديث اليوم 2024-02-11
- [ معلومات إسلامية ] زيادة في الرزق ومغفرة للذنوب .. تعرف على أهم 10 من فوائد كثرة الاستغفار # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ تعرٌف على ] ألفريد ف. فيرفل # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ مطاعم الامارات ] بيتزا هت خالدية ... أبوظبي # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ مجوهرات السعودية ] مؤسسة عبد اللطيف عبد الوهاب الصائغ # اخر تحديث اليوم 2024-03-27
- [ مطاعم الامارات ] الجولان كاتريا الخالدية العين ... العين # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ وسطاء عقاريين السعودية ] خالد بن ناصر بن مردف سهلي ... مكه المكرمه ... منطقة مكة المكرمة # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ تعرٌف على ] الدولة الموحدية # اخر تحديث اليوم 2024-03-27
- [ وسطاء عقاريين السعودية ] مريم سعيد محمد الزهراني ... الرياض ... منطقة الرياض # اخر تحديث اليوم 2024-03-27
- [ وسطاء عقاريين السعودية ] ريم مردف فارس الجهنى ... جدة ... منطقة مكة المكرمة # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ تعرٌف على ] معركة سرت (2011) # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- تلخيص فصول رواية أديب لطه حسين # اخر تحديث اليوم 2024-02-16
- [رقم هاتف] احمد ابو هشيمة..مصر 2020 # اخر تحديث اليوم 2024-03-18
- [ تعرٌف على ] ألفريد فيغنر # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ شركات الازياء والموضة قطر ] نجم الدوحة ngemm-eldoha ... الدوحة # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ وسطاء عقاريين السعودية ] يحيي محمد احمد بريك ... جازان ... منطقة جازان # اخر تحديث اليوم 2024-03-27
- [ محلات أحذية الامارات ] فيسيني للتجارة # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ وسطاء عقاريين السعودية ] طارق حامد فرج الجابري ... الطائف ... منطقة مكة المكرمة # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ مؤسسات البحرين ] خباز المردة ... المحرق # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ علاقات أسرية ] نصائح عن الأم # اخر تحديث اليوم 2024-03-27
- [ وسطاء عقاريين السعودية ] جبران غلفان شداد الجابري ... العارضه ... منطقة جازان # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ خدمات السعودية ] من هو رئيس جامعة طيبة الحالي 2023 # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ حكمــــــة ] يا طلبة العلم: إياكم والمراء ، فإنها ساعة جهل العالم ، وعندَها يبتغي الشيطان زَلَّتَهُ . # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ شركات السياحة والسفر قطر ] خطوط طيران الفلبين - قطر ... الدوحة # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
- [ خدمات السعودية ] أفضل أنواع السمك في السعودية 2023 وأماكن بيعها # اخر تحديث اليوم 2024-03-27
الأكثر قراءة
- مريم الصايغ في سطور
- سؤال و جواب | ما هى أسباب نزول الدم الاحمر بعد البراز؟ وهل هناك أسباب مرضية؟ وما الحل ؟
- سؤال وجواب | هل يجوز للرجل حلق شعر المؤخرة؟ وهل هناك طريقة محددة لذلك ؟
- سؤال و جواب | حلق شعر المؤخرة بالكامل و الأرداف ماحكمه شرعاً
- هل للحبة السوداء"حبة البركة "فوائد ؟
- كيف أتخلص من الغازات الكريهة التى تخرج مني باستمرار؟
- هناك ألم عندى فى الجانب الأيسر للظهر فهل من الممكن أن يكون بسبب الكلى ؟
- هل هناك علاج للصداع الئى أانيه فى الجانب الأيسر من الدماغ مع العين اليسرى ؟
- تعرٌف على ... مريم فايق الصايغ | مشاهير
- تفسير حلم رؤية القضيب أو العضو الذكري في المنام لابن سيرين
- مبادرة لدعم ترشيح رجل السلام صاحب السمو الشيخ محمد بن زايد لجائزة «نوبل للسلام»
- [ رقم تلفون ] مستر مندوب ... مع اللوكيشن المملكه العربية السعودية
- أرقام طوارئ الكهرباء بالمملكة العربية السعودية
- الفضاء اللوني (ص ش ض) و (ص ش ق) الاستخدام
- ارقام وهواتف مستشفى الدمرداش عباسية,بالقاهرة
- طرق الاجهاض المنزلية و ماهى افضل ادوية للاجهاض السريع واسقاط الجنين فى الشهر الاول
- تفسير رؤية لبس البدلة في المنام لابن سيرين
- تفسير حلم رؤية النكاح والجماع في المنام لابن سيرين
- [رقم هاتف] مؤسسة قرض الحسن .. لبنان
- نزع شوك السمك في المنام
- عبارات ترحيب قصيرة 40 من أجمل عبارات ترحيب للأحباب والأصدقاء 2021
- رؤية طفل بعيون خضراء في المنام
- ارقام وهواتف عيادة د. فاروق قورة - 3 أ ش يوسف الجندى باب اللوق بالقاهرة
- الحصول على رخصة بسطة في سوق الجمعة بدولة الكويت
- معلومات هامة عن سلالة دجاج الجميزة
- ارقام وهواتف مستشفى الهلال الاحمر 34 ش رمسيس وسط البلد بالقاهرة
- جريمة قتل آمنة الخالدي تفاصيل الجريمة
- رسائل حب ساخنة للمتزوجين +18
- خليفة بخيت الفلاسي حياته
- تعرٌف على ... عائشة العتيبي | مشاهير
- هل توجيه الشطاف للمنطقة الحساسة يعد عادة سرية؟ وهل يؤثر على البكارة؟
- رقم هاتف مكتب النائب العام وكيفية تقديم بلاغ للنائب العام
- [ رقم تلفون و لوكيشن ] شركة متجر كل شششي - المملكه العربية السعودية
- تفسير رؤية شخص اسمه محمد في المنام لابن سيرين
- ارقام وهواتف مطعم الشبراوى 33 ش احمد عرابى المهندسين, بالجيزة
- أسعار الولادة في مستشفيات الإسكندرية
- ارقام وهواتف عيادة د. هشام عبد الغنى - 10 ش مراد الجيزة بالجيزة
- ارقام وهواتف عيادة د. ياسر المليجى - 139 ش التحرير الدقى بالجيزة
- ارقام وهواتف مستشفى النور المحمدى الخيرى التخصصى المطرية, بالقاهرة
- تفسير رؤية الحشرات في المنام لابن سيرين
- [رقم هاتف] مؤسسة مركز اصلاح وتأهيل بيرين .. بالاردن الهاشمية
- قسم رقم 8 (فلم) قصة الفلم
- تفسير حلم رؤية الميت يشكو من ضرسه في المنام
- هل أستطيع الاستحمام بعد فض غشاء البكارة ليلة الدخلة مباشرة؟
- أعشاب تفتح الرحم للإجهاض
- يخرج المني بلون بني قريب من لون الدم، فما نصيحتكم؟!
- قناة تمازيغت برامج القناة
- ارقام وهواتف مكتب صحة - السادس من اكتوبر ميدان الحصرى السادس من اكتوبر, بالجيزة
- سور القران لكل شهر من شهور الحمل
- تفسير رؤية براز الكلاب في المنام لابن سيرين
- زخرفة اسماء تصلح للفيس بوك
- مدرسة ب/ 141 حكومي للبنات بجدة
- إلغ (برمجية) التاريخ
- [ رقم هاتف ] جمعية قرض الحسن، .... لبنان
- أشيقر سكان وقبائل بلدة أشيقر
- تفسير حلم رؤية قلب الخروف في المنام
- تفسير حلم الكلب لابن سيرين
- [ رقم هاتف ] عيادة د. حازم ابو النصر - 20 ش عبد العزيز جاويش عابدين بالقاهرة
- انا بنت عندي 13 سنة لسة مجتليش الدورة الشهرية ......كنت ببات عند خالتي وكل ما
- هل تمرير الإصبع بشكل أفقي على فتحة المهبل يؤدي إلى فض غشاء البكارة؟
- [رقم هاتف] شركة الحراسة و التوظيف و التنظيف.. المغرب
- قبيلة الهزازي أقسام قبيلة الهزازي
- ذا إكس فاكتور آرابيا فكرة البرنامج
- السلام عليكم ، أنا مشكلتي بصراحة الجنس من الخلف مع زوجي الأن صار ويحب حيل
- فتحة المهبل لدي واسعة وليست كما تبدو في الصور.. فهل هو أمر طبيعي؟
- لالة لعروسة (برنامج) الفائزون
- أنا حامل في الشهر الرابع وينزل مني دم .. هل هذا طبيعي؟
- [ رقم هاتف ] عيادة د. عادل الريس .. وعنوانها
- هل إدخال إصبع الزوج في مهبل الزوجة له أضرار؟
- تفسير حلم اصلاح الطريق في المنام
- هل الشهوة الجنسية الكثيرة تؤثر على غشاء البكارة؟ أفيدوني
- تفسير حلم تنظيف البيت في المنام للعزباء والمتزوجة والحامل والمطلقة
- إيمان ظاظا حياتها ومشوارها المهني
- أهمية وضرورة إزالة الخيط الأسود من ظهر الجمبري
- اسماء فيس بنات مزخرفة | القاب بنات مزخرفه
- لهجة شمالية (سعودية) بعض كلمات ومفردات اللهجة
- تفسير رؤية المشاهير في المنام لابن سيرين
- هل شد الشفرات والمباعدة الشديدة للساقين يمكن أن تفض غشاء البكارة؟
- [بحث جاهز للطباعة] بحث عن حرب 6 اكتوبر 1973 بالصور pdf doc -
- فوائد عشبة الفلية و الكمية المناسبة يوميا
- تفسير رؤية المخدة في المنام لابن سيرين
- [رقم هاتف] شركة الرفق بالحيوان و الطبيعة.. المغرب
- كلمات - انت روحي - حمود السمه
- أعاني من لحمة زائدة في الدبر ، فلدي قطعة لحمية صغيرة في فتحة الشرج من الخارج
- ما الفرق بين الغشاء السليم وغير السليم؟
- تفسير حلم رؤية الإصابة بالرصاص في الكتف بالمنام
- [ رقم هاتف ] مركز المصطفى للاشعة
- أدخلت إصبعي في المهبل وأخرجته وعليه دم، هل فقدت بكارتي؟
- عمر فروخ
- هل الضغط بالفخذين على الفرج يؤذي غشاء البكارة?
- إدمان الزوج للمواقع الإباحية: المشكلة والأسباب والعلاج
- بسبب حكة قويط للمنطقة الحساسة ونزول الدم، أعيش وسواس فض الغشاء.
- ما تفسير رؤية كلمة كهيعص في المنام
- تظهر عندي حبوب في البظر والشفرتين بين حين وآخر.. هل لها مضاعفات، وما علاجها؟
- طريقة إرجاع حساب الفيس بوك المعطل
- الكرة الحديدية قواعد اللعبة
- تفسير رؤية مدرس الرياضيات في المنام لابن سيرين
- [بحث جاهز للطباعة] بحث عن اللغة العربية والكفايات اللغويه -
- تفسير حلم رؤية الكنز فى المنام لابن سيرين
- كيف أصل إلى النشوة مع زوجي أثناء الإيلاج وليس بيده بعد الجماع؟
مرحبا بكم في شبكة بحوث وتقارير ومعلومات
عزيزي زائر شبكة بحوث وتقارير ومعلومات.. تم إعداد وإختيار هذا الموضوع [ تعرٌف على ] لطخة ويسترن # اخر تحديث اليوم 2024-03-28 فإن كان لديك ملاحظة او توجيه يمكنك مراسلتنا من خلال الخيارات الموجودة بالموضوع.. وكذلك يمكنك زيارة القسم , وهنا نبذه عنها وتصفح المواضيع المتنوعه... آخر تحديث للمعلومات بتاريخ اليوم 10/11/2023
[ تعرٌف على ] لطخة ويسترن # اخر تحديث اليوم 2024-03-28
آخر تحديث منذ 4 شهر و 19 يوم
1 مشاهدة
تم النشر اليوم 2024-03-28 | لطخة ويسترن
طريقة مختبر الدكتور مارك بارتون فرانك
إحدى اختيارات الكشف على فيروس نقص المناعة البشرية توظف لطخة ويسترن لاكتشاف الجسم المضاد للفيروس فيروس العوز المناعي البشري في عينة مصل الإنسان. بروتينات من خلايا معروفة الإصابة بفيروس HIV يتم فصلها وبقعها على غشاء كما في أعلاه. ثم، يتم تجربة المصل بصورة جسم مضاد أولي؛ ثم يتم غسل الأجسام المضادة غير الملتصقة، ويتم وضع جسم مضاد ثانوي ضد-بشري مرتبط بإنزيم الإشارة. الحزم المصبوغة تدل على البروتينات التي تتعرف عليها الأجسام المضادة في مصل المريض.
يتم أيضاً استخدام لطخة ويسترن كاختيار مؤكد لمرض جنون البقر (Bovine spongiform encephalopathy (BSE.
يتم استخدام لطخة ويسترن لاختيار بعض أنواع مرض لايم Lyme disease (الذي هو التهاب بكتيري).
إس دي إس بايج ثنائي الأبعاد يستعمل المبادئ والتقنيات المُشار إليها اعلاه. كما يشير الاسم، فإن هذه الطريقة تشمل هجرة سلسلة البروتينات في بعدين. في البُعد الأول تقوم السلسلة البروتينية بالأنفصال حسب نقطة التعادل الكهربي. أما في البعد الثاني تنفصل السلسلة البروتينية حسب وزنها الجزيئي. تُقاس نقطة التعادل الكهربي لبروتين مُعين بواسطة الرقم النسبي للأحماض الأمينية الموجبة (كاللايسين) والسالبة (كالجلوتاميت)، وتقوم الأحماض الأمينية السالبة بتزويد أعلى نقطة تعادل كهربي، ومن جهة أخرى تقوم الأحماض الامينية الموجبة بتزويد أقل نقطة تعادل كهربي. تسمح هذه الطريقة بفصل كل البروتينات الخلوية على هلام مفرد وكبير. من الفوائد المهمة لهذه الطريقة هي التمييز بين الأشكال المُختلفة لبروتين مُعين (مثلاَ البروتين الذي تمت فسفرتهُ، أي إضافة المجموعة السالبة الشُحنة). يُمكن قطع البروتين الذي تم فَصله من الهُلام وبعدها يتم تحليله بواسطة جهاز تحليل الكتلة mass spectrometry الذي يقوم باكتشاف البروتين وتحديد هويته.
تحضير الأنسجة
يمكن أخذ العينات من أنسجة كاملة أو من زراعة الخلايا. يتم كسر الأنسجة الصلبة ميكانيكيًا، في أغلب الأحيان، باستخدام خلاّط (لإحجام عينات كبيرة)، باستخدام مجنس homogenizer (للأحجام الأصغر)، أو بالصوتنة Sonication. يمكن كسر وفتح الخلايا بإحدى الطرق المذكورة أعلاه أيضًا. يمكن توظيف العديد من المنظفات والأملاح والمحاليل لتشجيع التكسر الخلوي ولإذابة البروتينات. يتم أيضًا إضافة مثبطات (موانع) البروتييزات والفسفاتازات Protease and Phosphatase Inhibitors وذلك لمنع تآكل العينة بإنزيماتها الخاصة. يتم استخدام مجموعة من التقنيات الميكانيكية والكيمياحيوية (البايوكيميائية) من ضمنها أيضًا العديد من أنواع التصفية والطرد المركزي لفصل أجزاء أو عضيات معينة من الخلايا.
الفصل الكهربائي للهلام
المقالة الرئيسة: فصل كهربائي للهلام
يتم فصل بروتينات العينة باستخدام الفصل الكهربائي. فصل البروتينات قد يكون باستخدام النقطة متوازنة الكهربية Isoelectric point (pI)، الوزن الجزيئي، الشحنة الكهربائية، أو مجموعة من هذه العوامل. طبيعة الفصل تعتمد على طريقة معالجة العينة وطبيعة الهلام. إلى حد الآن، الطريقة الأكثر شيوعاً للفصل الكهربائي للهلام توظف هلامات متعدد الأكريلامايد polyacrylamide ومحاليل تحتوي على كبريتات دوديكل الصوديوم Sodium Dodecyl Sulfate (SDS). إس دي إس بايج أي (الفصل الكهربائي لهلام كبريتات دوديكل الصوديوم متعدد الأكريلامايد SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) تحافظ على سلسلة البروتيات في حالة مفككة denatured state حالماً يتم معالجتهم مع عوامل اختزال قوية للقضاء على الأشكال الثانوية والثالثية. (مثل تحويل الروابط ثنائية الكبريت S-S إلى SH وSH) وبذلك يسمح لفصل البروتينات حسب وزنهم الجزيئي. يتم تغطية البروتينات في العينة بكبريتات دوديكل الصوديوم السالبة الشحنة ونقلها إلى القطب الكهربائي الموجب الشحنة خلال شبكة الأكريلامايد في الهلام. البروتينات الصغيرة تهاجر أسرع خلال هذه الشبكة وبذلك يتم فصل البروتينات حسب الحجم (عادة ما يتم قياسها بالكيلودالتون، kD، kiloDaltons). تركيز الأكريلامايد يحدد دقة الهلام - كلما زاد تركيز الأكريلامايد كلما زادت دقة البروتينات ذات الأوزان الجزيئية العالية. البروتينات تهاجر ببعد واحد خلال الهلام لأغلب اللطخات.
الهلام ويلاحظ فيه الدرج بصورة حزم زرقاء اللون بسبب الصبغة الزرقاء كوماسي بلو Coomassie Blue
يتم تحميل العينات في آبار في الهلام. يتم حفظ إحدي الأسطر للـ درج أو العلامات، وهما خليط متوفر تجارياً من عدة بروتينات معروفة الوزن الجزيئي، عادة ما تكون مصبوغة لكي تُظهر حزم ملونة مرئية. أحد الأمثلة على الدرج، هو درج الأوزان الجزيئية الكامل المدى لشركة GE (كما في الشكل). عندما يتم تطبيق فرق الجهد على الهلام، تهاجر البروتينات ضمنه بسرعات مختلفة. هذه المعدلات الزمنية المختلفة للتقدم (حركات الفصل الكهربائي المختلفة) تُفصل إلى حُزم ضم كل سطر. من الممكن أيضاً استخدام الفصل الكهربائي ثنائي الأبعاد الذي يفصل البروتينات من عينة واحدة في بُعدين. البروتينات تفصل بحسب النقطة متوازنة الكهربية (تركيز أيونات الهيدروجين pH الذي تكون فيه الشحنة متعادلة) في البعد الأول، وبحسب الوزن الجزيئي في البعد الثاني. النقل
من أجل جعل الوصول للبروتينات أسهل للاكتشاف بالأجسام المضادة، يتم نقلهم من الهلام إلى غشاء مصنوع من النيتروسيليوز أو الـPVDF. يتم وضع هذا الغشاء فوق الهلام، ووضع مجموعة من طبقات أوراق الترشيح فوق ذلك. ثم يتم وضع الطبقات كلها في محلول يقوم بالتنقل إلى الأعلى عبر الأوراق بالخاصية الشعرية Capillary action، جالباً البروتينات معه إلى الغشاء. ومن الطرق الأخرى لنقل البروتينات تدعى اللطخة الكهربائية وتستخدم تياراً كهربائياً لسحب البروتينات من الهلام إلى الغشاء. البروتينات الآن نُقلت من داخل الهلام إلى سطح غشاء من النيتروسيليلوز أو PVDF مع ثباء الترتيب التي كانت البروتينات عليه داخل الهلام. ويكون ناتج هذه العملية، هو عرض البروتينات على سطح رقيق للاكتشاف (انظر أسفلاً). كلا نوعي الغشاء (نيتروسيليلوز أو PVDF) يتم اختيارهم لخاصية الالتصاق غير المحدد بالبروتينات (أي أنهم يلتصقون بأي بروتين بصورة متساوية). التصاق البروتينات مبني على تفاعلات مصابة بفوبيا الماء hydrophobic interactions)، بالإضافة إلى التفاعلات المشحونة بين الغشاء والبروتين. إن أغشية النيتروسيليلوز تكون أقل كلفة من الـ PVDF، ولكنها هشة أكثر ولا تستطيع الوقوف لتحقيقات مجددة reprobes كثيرة.
التأثير الكلّي والموحّد لنقل البروتين من الهلام إلى الغشاء يمكن التأكد منه بصبغ الغشاء بصبغة كوماسي Coomassie أو بونسو س Ponceau S. كوماسي هي الصبغة الأكثر حساسية من الصبغتين، بالرغم من أن سهولة ذوبان بونسو س في الماء تجعله أسهل للإزالة لاحقاً والتحقق من الغشاء كما في أدناه. السد
بما أنه تم اختيار الغشاء لقابليته على الالتصاق بالبروتينات، وكلاً من الأجسام المضادة والأهداف هما بروتينات، يجب إتخاذ إجراءات خاصة لمنع التفاعلات بين الغشاء والجسم المضاد المستخدم لاكتشاف البروتين الهدف. يتم سد الالتصاق غير المحدد عن طريق وضع الغشاء في محلول مخفف من بروتين - عادة ما يكون هذا البروتين هو ألبومين مصل البقر Bovine Serum Albumin المعروف بالـ BSA أو حليب من غير دهون (كلاهما ليسا مكلفان)، مع مقدار صغير من منظف مثل توين 20 Tween. البروتين في المحلول المخفف يلتصق بالغشاء في كل الأماكن الغير محتوية على البروتينات الهدف. وبهذا، عندما يتم إضافة الجسم المضاد، لن يكون هناك مكان له ليلتصق غير على مواقع الالتصاق على البروتين الهدف المحدد. هذا يقلل «التشويش» في النتيجة النهائية للطخة ويسترن، ويؤدي إلى نتائج أوضح، ويقضي على النتائج الإيجابية المزيفة. الاكتشاف
خلال عملية الاكتشاف، يتم التحقق من وجود البروتين المطلوب على الغشاء عن طريق جسم مضاد معدل مرتبط بإنزيم مراسل، الذي عند وضع مادة معينة عليه يسبب تفاعل لوني ويقوم بإنتاج لون معين. ولعدة أسباب، فإن هذه الخطوة تتم بخطوتين، بالرغم من أن الآن يوجد طرق اكتشاف ذات خطوة واحدة لبعض الاستخدامات. الخطوتين
الجسم المضاد الأولي
يتم تكوين الأجسام المضادة عندما يتم عرض البروتين المطلوب (أو جزءاً منه) على المستضيف أو خلايا المناعة المزروعة. عادةً، يكون هذا جزءاً من الاستجابة المناعية، ولكن هنا يتم حصد الأجسام المضادة واستخدامها كأدوات اكتشاف دقيقة وحساسة تلتصق بالبروتين مباشرة. بعد عملية السد، يتم احتضان الغشاء في محلول مخفف من الجسم المضاد الأولي (عادة بتركيز بين 0,5 ميكروغرام/مل إلى 5 ميكروغرام/مل) مع التحريك الخفيف. بشكله النموذجي، يحتوي المحلول على محاليل ملحية مع نسبة صغيرة من المنظفات، وأحياناً مسحوق حليب أو ألبومين مصل البقر BSA. يمكن وضع محلول الجسم المضاد والغشاء معاً واحتضانهما لأي فترة بين 30 دقيقة إلى عبر الليل. ويمكن أيضاً احتضانهما في درجات حرارة مختلفة، حيث تكون الدرجات الدافئة أكثر محفزة على الالتصاق (لكلا نوعي الالتصاق، الالتصاق المحدد والالتصاق الغير محدد «التشويش»). الجسم المضاد الثانوي
بعد تنقيع الغشاء أو غسله لإزالة الأجسام المضادة الأولية الغير ملتصقة، يتم إضافة جسم مضاد آخر للغشاء، موجه نحو جزء خاص-لنوع species-specific الجسم المضاد الأولي. وهذا يعرف بالجسم المضاد الثانوي، وبسبب خواصه المستهدِفة، يتم تسميته بـ«ضد-الفأر»، «ضد-العنز»، «ضد-الجرذ»، الخ. الأجسام المضادة تأتي من مصادر الحيوانات (أو زراعة خلايا هيبريدوما حيوانية)؛ فالجسم المضاد الثانوي ضد-الفأر سيلتصق لأي جسم مضاد أولي مصدره الفأر. وهذا يسمح لتوفير المصاريف بالسماح لكل المختبر من استخدام مصدر واحد من جسم مضاد منتج بكثرة، ويوفر نتائج منسقة أكثر بكثير. عادة ما يكون الجسم المضاد الثانوي مرتبط بجزيئة بايوتين أو إلى إنزيم مراسل مثل فسفاتاز قلوي Alkaline phosphatase أو بيروكسيداز الفجل الحار Horseradish peroxidase. هذا يعني أن عدة أجسام مضادة ثانوية ستلتصق بجسم مضاد أولي واحد وتقوم بتعزيز الإشارة للاكتشاف.
غالباً ما يتم استخدام جسم مضاد ثانوي مرتبط ببيروكسيداز الفجل مع عامل مضيء كيميائي، وينتج التفاعل بينهما ضوءاً بمقدار كمية البروتين. يتم استخدام طبقة حساسة من الفيلم الفوتوغرافي لخلق صورة للأجسام المضادة الملتصقة باللطخة. كما في إجراءات الإيلايزا الإيلايزبوت، يمكن تزويد الأنزيم بجزيئة التي يحولها الإنزيم إلى ناتج تفاعل ملون يمكن رؤيته على الغشاء. البديل الثالث هو استخدام علامة مشعة بدل إنزيم متصل بالجسم المضاد الثانوي، مثل ربط بروتين يلتصق بالأجسام المضادة (مثل بروتين أ من العنقودية Staphylococcus) بنظير مشع من اليود. ولكن بما أنه الطرق الأخرى هي أكثر أماناً، وأسرع وأرخص، قلّ ما يتم استخدام هذه الطريقة الآن. الخطوة الواحدة
تأريخياً، كانت عملية التحقق تُجرى بخطوتين وذلك بسبب السهولة النسبية لإنتاج أجسام مضادة أولية وثانوية من ناحية المرونة، وأيضاً يضيف خطوة تكبير للإشارة لعملية الاكتشاف. نظراً للقدرة الإنتاجية العالية لتحليل البروتينات وانخفاض حدود الإشارة المطلوبة للكشف، تم تطوير طرق تحقُّق ذات خطوة واحدة والتي تستطيع أن تحدث بصورة أسرع مع تقليل استخدام المستهلكات. وهذا يتطلب جسم مضاد ملتقط الذي يتعرف على البروتين المطلوب ويحتوي على علامات اكتشاف/التقاط، وغالباً ما يكون هناك ملتقطات للبروتينات المؤشرة Protein tags. يتم احتضان الملتقط الأولي مع الغشاء بطريقة مشابهة للجسم المضاد الأولي في طريقة الخطوتين، ومن ثم يكون جاهز للكشف بعد سلسلة من خطوات الغسل. لطخة ويسترن باستخدام طريقة الاكتشاف المشع
التحليل
بعد أن يتم غسل الملتقطات الغير ملتصقة، تصبح لطخة ويسترن جاهزة للاكتشاف عن طريق الملتقطات الملتصقة بالبروتين المراد اكتشاف وجوده أو عدمه. في المصطلحات العملية، لا تُظهر كل لطخات ويسترن البروتين بصورة حزمة واحدة فقط على الغشاء.
يتم أخذ تقديرات الحجم عن طريق مقارنة الحزم المكتشفة بحزم الدرج المصبوغة التي تم تحميلها عند خطوة الفصل الكهربائي. يتم إعادة هذه العملية لبروتين هيكلي، مثل الأكتين أو التيوبيولين، الذي لا يجب تغيير تركيزه بين العينات. كمية البروتين الموجودة تتم مقارنتها بالبروتين الهيكلي لكي يتم السيطرة على المجموعات العدة. هذه الطريقة تؤكد تصحيح التغييرات الدارجة بسبب عدم انتقال البروتين أو وجود أخطاء في التجربة. الاكتشاف اللوني Colorimetric detection
طريقة الاكتشاف اللوني تعتمد على احتضان لطخة ويسترن مع المادة التي ستتفاعل مع الإنزيم المراسل (مثل البيروكسيداز Peroxidase) الذي يكون مرتبط بالجسم المضاد الثانوي. هذا يحول الصبغة الذائبة إلى شكل غير ذائب بلون مختلف والتي تترسب قرب الإنزيم وبالتالي تصبغ غشاء النيتروسيليلوز. يتم إيقاف تحميض اللطخة عندها عن طريق غسل الصبغة الذائبة. يتم تحليل كمية البروتينات باستخدام قياس الكثافة densitometry (أي ما هي كثافة البقعة/الصبغة) أو قياس الضوء spectrophotometry. الإضاءة الكيميائية Chemiluminescence
تعتمد طريقة الاكتشاف بالإضاءة الكيميائية على احتضان لطخة ويسترن مع المادة التي تضيء عندما تتصل بالجزيء المراسل على الجسم المضاد الثانوي. وعندها يتم التقاط الضوء باستخدام فيلم فوتوغرافي، ومؤخراً باستخدام كاميرات سي سي دي CCD cameras تلتقط صورة رقمية للطخة ويسترن. هذه الصورة يتم تحليلها باستخدام مقياس الكثافة الذي يحلل كمية الصبغة البروتينية النسبية ويقوم بالتحليل الكمي عن طريق الكثافة الضوئية. يوجد برامج جديدة تساعد على تحليلات البيانات بصورة أخرى مثل تحليل الوزن الجزيئي إذا تم استخدام مقاييس صحيحة. يعتبر ما يسمى بالمضيء الكيميائي المحسن Enhanced chemiluminscent أو ECL هو من ضمن أكثر الطرق حساسية للاكتشاف التحليلي للطخة ويسترن.
الاكتشاف المشع Radioactive detection
العلامات المشعة لا تحتاج إلى مواد إنزيمية، ولكن فقط وضع أفلام أشعة سينية طبية مباشرة على لطخة ويسترن والذي يقوم بخلق أجزاء غامقة على الفيلم تعود إلى حزم البروتينات المطلوب كشفها (انظر الصورة). قلت أهمية طرق الاكتشاف المشع، بسبب كونها مكلفة، ولها أخطار صحية عالية، كما أن المضيء الكيميائي المحسن ECL يعتبر بدل مفيد جداً. الاكتشاف الفلوري Fluorescent detection
يتم تحفيز الملتقط ذو العلامات الفلورية بواسطة الضوء والانبعاث من التحفيز وبذلك يتم الاستدلال عليه بواسطة متحسس ضوئي مثل كاميرا سي سي دي المزودة بمرشح باعث مناسب حيث يقوم بألتقاط الصورة الرقمية للطخة ويسترن ويقوم بالسماح لتحليل بيانات أخرى كالوزن الجزيئي والتحليل الكمي للطخة ويسترن. يعتبر الملتقط الفلوري من بين أكثر الطُرق حساسية لتحليل اللطخة. التحقق الثانوي
أحد الاختلافات الكبيرة بين غشائي النيتروسيليلوز وPVDF يعود إلى قابلية كل منهم على القيام بـ«تعرية» للأجسام المضادة وإعادة الاستخدام لأجسام مضادة ملتقطة لاحقاً. وبالرغم من أن هناك طرق مختبرة لتعرية أغشية النيتروسيليلوز، تظل أغشية الـPVDF أسهل تعرية، وتسهل استخدام أكثر قبل أن يقوم التشويش الخلفي بإعاقة التجارب. أحد الاختلافات الأخرى هو، بعكس النيتروسيليلوز، الـPVDF يجب أن ينقع في 95% إيثانول، بروبانول أو ميثانول قبل الاستخدام. أغشية الـPVDF أيضاً تكون أكثر سمكاً وأكثر مقاومة للضرر خلال الاستخدام.
في التقنيات الحيوية، لطخة ويسترن (بالإنجليزية: Western Blot) (تعرف أيضا باللطخة المناعية Immunoblot) هي طريقة اكتشاف بروتين معين في عينة أو مستخلص أنسجة، وهي من التقنيات الحيوية المخبرية. تستخدم الفصل الكهربائي للهلام لفصل البروتينات الطبيعية native proteins أو البروتينات المُتَمَسِّخة denatured proteins حسب طول السلاسل البروتينية (ظروف مفككة) أو حسب الشكل الثلاثي الأبعاد للبروتين (ظروف قومية/غير مفككة). يتم، في ما بعد، نقل البروتينات إلى غشاء (عادة ما يكون الغشاء مصنوعا من مادة النيتروسيليلوز أو ثنائي فلوريد متعدد الفينيليدين)، حيث يتم التحقق (الاكتشاف) باستخدام أضداد مخصصة للبروتين الهدف. هناك الآن العديد من شركات المواد التي تتخصص في تجهيز أضداد (مستنسخة ومتعددة النسائل) ضد آلاف البروتينات المختلفة. وقد قام هذا بتقليل الوقت الذي تحتاجه لعمل لطخة بصورة كبيرة.
الطرق
طريقة مختبر الدكتور مارك بارتون فرانك
الاستخدامات في الفحص الطبي
إحدى اختيارات الكشف على فيروس نقص المناعة البشرية توظف لطخة ويسترن لاكتشاف الجسم المضاد للفيروس فيروس العوز المناعي البشري في عينة مصل الإنسان. بروتينات من خلايا معروفة الإصابة بفيروس HIV يتم فصلها وبقعها على غشاء كما في أعلاه. ثم، يتم تجربة المصل بصورة جسم مضاد أولي؛ ثم يتم غسل الأجسام المضادة غير الملتصقة، ويتم وضع جسم مضاد ثانوي ضد-بشري مرتبط بإنزيم الإشارة. الحزم المصبوغة تدل على البروتينات التي تتعرف عليها الأجسام المضادة في مصل المريض.
يتم أيضاً استخدام لطخة ويسترن كاختيار مؤكد لمرض جنون البقر (Bovine spongiform encephalopathy (BSE.
يتم استخدام لطخة ويسترن لاختيار بعض أنواع مرض لايم Lyme disease (الذي هو التهاب بكتيري).
الفصل الكهربائي للهلام ببعدين
إس دي إس بايج ثنائي الأبعاد يستعمل المبادئ والتقنيات المُشار إليها اعلاه. كما يشير الاسم، فإن هذه الطريقة تشمل هجرة سلسلة البروتينات في بعدين. في البُعد الأول تقوم السلسلة البروتينية بالأنفصال حسب نقطة التعادل الكهربي. أما في البعد الثاني تنفصل السلسلة البروتينية حسب وزنها الجزيئي. تُقاس نقطة التعادل الكهربي لبروتين مُعين بواسطة الرقم النسبي للأحماض الأمينية الموجبة (كاللايسين) والسالبة (كالجلوتاميت)، وتقوم الأحماض الأمينية السالبة بتزويد أعلى نقطة تعادل كهربي، ومن جهة أخرى تقوم الأحماض الامينية الموجبة بتزويد أقل نقطة تعادل كهربي. تسمح هذه الطريقة بفصل كل البروتينات الخلوية على هلام مفرد وكبير. من الفوائد المهمة لهذه الطريقة هي التمييز بين الأشكال المُختلفة لبروتين مُعين (مثلاَ البروتين الذي تمت فسفرتهُ، أي إضافة المجموعة السالبة الشُحنة). يُمكن قطع البروتين الذي تم فَصله من الهُلام وبعدها يتم تحليله بواسطة جهاز تحليل الكتلة mass spectrometry الذي يقوم باكتشاف البروتين وتحديد هويته.
خطوات لطخة ويسترن
تحضير الأنسجة
يمكن أخذ العينات من أنسجة كاملة أو من زراعة الخلايا. يتم كسر الأنسجة الصلبة ميكانيكيًا، في أغلب الأحيان، باستخدام خلاّط (لإحجام عينات كبيرة)، باستخدام مجنس homogenizer (للأحجام الأصغر)، أو بالصوتنة Sonication. يمكن كسر وفتح الخلايا بإحدى الطرق المذكورة أعلاه أيضًا. يمكن توظيف العديد من المنظفات والأملاح والمحاليل لتشجيع التكسر الخلوي ولإذابة البروتينات. يتم أيضًا إضافة مثبطات (موانع) البروتييزات والفسفاتازات Protease and Phosphatase Inhibitors وذلك لمنع تآكل العينة بإنزيماتها الخاصة. يتم استخدام مجموعة من التقنيات الميكانيكية والكيمياحيوية (البايوكيميائية) من ضمنها أيضًا العديد من أنواع التصفية والطرد المركزي لفصل أجزاء أو عضيات معينة من الخلايا.
الفصل الكهربائي للهلام
المقالة الرئيسة: فصل كهربائي للهلام
يتم فصل بروتينات العينة باستخدام الفصل الكهربائي. فصل البروتينات قد يكون باستخدام النقطة متوازنة الكهربية Isoelectric point (pI)، الوزن الجزيئي، الشحنة الكهربائية، أو مجموعة من هذه العوامل. طبيعة الفصل تعتمد على طريقة معالجة العينة وطبيعة الهلام. إلى حد الآن، الطريقة الأكثر شيوعاً للفصل الكهربائي للهلام توظف هلامات متعدد الأكريلامايد polyacrylamide ومحاليل تحتوي على كبريتات دوديكل الصوديوم Sodium Dodecyl Sulfate (SDS). إس دي إس بايج أي (الفصل الكهربائي لهلام كبريتات دوديكل الصوديوم متعدد الأكريلامايد SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) تحافظ على سلسلة البروتيات في حالة مفككة denatured state حالماً يتم معالجتهم مع عوامل اختزال قوية للقضاء على الأشكال الثانوية والثالثية. (مثل تحويل الروابط ثنائية الكبريت S-S إلى SH وSH) وبذلك يسمح لفصل البروتينات حسب وزنهم الجزيئي. يتم تغطية البروتينات في العينة بكبريتات دوديكل الصوديوم السالبة الشحنة ونقلها إلى القطب الكهربائي الموجب الشحنة خلال شبكة الأكريلامايد في الهلام. البروتينات الصغيرة تهاجر أسرع خلال هذه الشبكة وبذلك يتم فصل البروتينات حسب الحجم (عادة ما يتم قياسها بالكيلودالتون، kD، kiloDaltons). تركيز الأكريلامايد يحدد دقة الهلام - كلما زاد تركيز الأكريلامايد كلما زادت دقة البروتينات ذات الأوزان الجزيئية العالية. البروتينات تهاجر ببعد واحد خلال الهلام لأغلب اللطخات.
الهلام ويلاحظ فيه الدرج بصورة حزم زرقاء اللون بسبب الصبغة الزرقاء كوماسي بلو Coomassie Blue
يتم تحميل العينات في آبار في الهلام. يتم حفظ إحدي الأسطر للـ درج أو العلامات، وهما خليط متوفر تجارياً من عدة بروتينات معروفة الوزن الجزيئي، عادة ما تكون مصبوغة لكي تُظهر حزم ملونة مرئية. أحد الأمثلة على الدرج، هو درج الأوزان الجزيئية الكامل المدى لشركة GE (كما في الشكل). عندما يتم تطبيق فرق الجهد على الهلام، تهاجر البروتينات ضمنه بسرعات مختلفة. هذه المعدلات الزمنية المختلفة للتقدم (حركات الفصل الكهربائي المختلفة) تُفصل إلى حُزم ضم كل سطر. من الممكن أيضاً استخدام الفصل الكهربائي ثنائي الأبعاد الذي يفصل البروتينات من عينة واحدة في بُعدين. البروتينات تفصل بحسب النقطة متوازنة الكهربية (تركيز أيونات الهيدروجين pH الذي تكون فيه الشحنة متعادلة) في البعد الأول، وبحسب الوزن الجزيئي في البعد الثاني. النقل
من أجل جعل الوصول للبروتينات أسهل للاكتشاف بالأجسام المضادة، يتم نقلهم من الهلام إلى غشاء مصنوع من النيتروسيليوز أو الـPVDF. يتم وضع هذا الغشاء فوق الهلام، ووضع مجموعة من طبقات أوراق الترشيح فوق ذلك. ثم يتم وضع الطبقات كلها في محلول يقوم بالتنقل إلى الأعلى عبر الأوراق بالخاصية الشعرية Capillary action، جالباً البروتينات معه إلى الغشاء. ومن الطرق الأخرى لنقل البروتينات تدعى اللطخة الكهربائية وتستخدم تياراً كهربائياً لسحب البروتينات من الهلام إلى الغشاء. البروتينات الآن نُقلت من داخل الهلام إلى سطح غشاء من النيتروسيليلوز أو PVDF مع ثباء الترتيب التي كانت البروتينات عليه داخل الهلام. ويكون ناتج هذه العملية، هو عرض البروتينات على سطح رقيق للاكتشاف (انظر أسفلاً). كلا نوعي الغشاء (نيتروسيليلوز أو PVDF) يتم اختيارهم لخاصية الالتصاق غير المحدد بالبروتينات (أي أنهم يلتصقون بأي بروتين بصورة متساوية). التصاق البروتينات مبني على تفاعلات مصابة بفوبيا الماء hydrophobic interactions)، بالإضافة إلى التفاعلات المشحونة بين الغشاء والبروتين. إن أغشية النيتروسيليلوز تكون أقل كلفة من الـ PVDF، ولكنها هشة أكثر ولا تستطيع الوقوف لتحقيقات مجددة reprobes كثيرة.
التأثير الكلّي والموحّد لنقل البروتين من الهلام إلى الغشاء يمكن التأكد منه بصبغ الغشاء بصبغة كوماسي Coomassie أو بونسو س Ponceau S. كوماسي هي الصبغة الأكثر حساسية من الصبغتين، بالرغم من أن سهولة ذوبان بونسو س في الماء تجعله أسهل للإزالة لاحقاً والتحقق من الغشاء كما في أدناه. السد
بما أنه تم اختيار الغشاء لقابليته على الالتصاق بالبروتينات، وكلاً من الأجسام المضادة والأهداف هما بروتينات، يجب إتخاذ إجراءات خاصة لمنع التفاعلات بين الغشاء والجسم المضاد المستخدم لاكتشاف البروتين الهدف. يتم سد الالتصاق غير المحدد عن طريق وضع الغشاء في محلول مخفف من بروتين - عادة ما يكون هذا البروتين هو ألبومين مصل البقر Bovine Serum Albumin المعروف بالـ BSA أو حليب من غير دهون (كلاهما ليسا مكلفان)، مع مقدار صغير من منظف مثل توين 20 Tween. البروتين في المحلول المخفف يلتصق بالغشاء في كل الأماكن الغير محتوية على البروتينات الهدف. وبهذا، عندما يتم إضافة الجسم المضاد، لن يكون هناك مكان له ليلتصق غير على مواقع الالتصاق على البروتين الهدف المحدد. هذا يقلل «التشويش» في النتيجة النهائية للطخة ويسترن، ويؤدي إلى نتائج أوضح، ويقضي على النتائج الإيجابية المزيفة. الاكتشاف
خلال عملية الاكتشاف، يتم التحقق من وجود البروتين المطلوب على الغشاء عن طريق جسم مضاد معدل مرتبط بإنزيم مراسل، الذي عند وضع مادة معينة عليه يسبب تفاعل لوني ويقوم بإنتاج لون معين. ولعدة أسباب، فإن هذه الخطوة تتم بخطوتين، بالرغم من أن الآن يوجد طرق اكتشاف ذات خطوة واحدة لبعض الاستخدامات. الخطوتين
الجسم المضاد الأولي
يتم تكوين الأجسام المضادة عندما يتم عرض البروتين المطلوب (أو جزءاً منه) على المستضيف أو خلايا المناعة المزروعة. عادةً، يكون هذا جزءاً من الاستجابة المناعية، ولكن هنا يتم حصد الأجسام المضادة واستخدامها كأدوات اكتشاف دقيقة وحساسة تلتصق بالبروتين مباشرة. بعد عملية السد، يتم احتضان الغشاء في محلول مخفف من الجسم المضاد الأولي (عادة بتركيز بين 0,5 ميكروغرام/مل إلى 5 ميكروغرام/مل) مع التحريك الخفيف. بشكله النموذجي، يحتوي المحلول على محاليل ملحية مع نسبة صغيرة من المنظفات، وأحياناً مسحوق حليب أو ألبومين مصل البقر BSA. يمكن وضع محلول الجسم المضاد والغشاء معاً واحتضانهما لأي فترة بين 30 دقيقة إلى عبر الليل. ويمكن أيضاً احتضانهما في درجات حرارة مختلفة، حيث تكون الدرجات الدافئة أكثر محفزة على الالتصاق (لكلا نوعي الالتصاق، الالتصاق المحدد والالتصاق الغير محدد «التشويش»). الجسم المضاد الثانوي
بعد تنقيع الغشاء أو غسله لإزالة الأجسام المضادة الأولية الغير ملتصقة، يتم إضافة جسم مضاد آخر للغشاء، موجه نحو جزء خاص-لنوع species-specific الجسم المضاد الأولي. وهذا يعرف بالجسم المضاد الثانوي، وبسبب خواصه المستهدِفة، يتم تسميته بـ«ضد-الفأر»، «ضد-العنز»، «ضد-الجرذ»، الخ. الأجسام المضادة تأتي من مصادر الحيوانات (أو زراعة خلايا هيبريدوما حيوانية)؛ فالجسم المضاد الثانوي ضد-الفأر سيلتصق لأي جسم مضاد أولي مصدره الفأر. وهذا يسمح لتوفير المصاريف بالسماح لكل المختبر من استخدام مصدر واحد من جسم مضاد منتج بكثرة، ويوفر نتائج منسقة أكثر بكثير. عادة ما يكون الجسم المضاد الثانوي مرتبط بجزيئة بايوتين أو إلى إنزيم مراسل مثل فسفاتاز قلوي Alkaline phosphatase أو بيروكسيداز الفجل الحار Horseradish peroxidase. هذا يعني أن عدة أجسام مضادة ثانوية ستلتصق بجسم مضاد أولي واحد وتقوم بتعزيز الإشارة للاكتشاف.
غالباً ما يتم استخدام جسم مضاد ثانوي مرتبط ببيروكسيداز الفجل مع عامل مضيء كيميائي، وينتج التفاعل بينهما ضوءاً بمقدار كمية البروتين. يتم استخدام طبقة حساسة من الفيلم الفوتوغرافي لخلق صورة للأجسام المضادة الملتصقة باللطخة. كما في إجراءات الإيلايزا الإيلايزبوت، يمكن تزويد الأنزيم بجزيئة التي يحولها الإنزيم إلى ناتج تفاعل ملون يمكن رؤيته على الغشاء. البديل الثالث هو استخدام علامة مشعة بدل إنزيم متصل بالجسم المضاد الثانوي، مثل ربط بروتين يلتصق بالأجسام المضادة (مثل بروتين أ من العنقودية Staphylococcus) بنظير مشع من اليود. ولكن بما أنه الطرق الأخرى هي أكثر أماناً، وأسرع وأرخص، قلّ ما يتم استخدام هذه الطريقة الآن. الخطوة الواحدة
تأريخياً، كانت عملية التحقق تُجرى بخطوتين وذلك بسبب السهولة النسبية لإنتاج أجسام مضادة أولية وثانوية من ناحية المرونة، وأيضاً يضيف خطوة تكبير للإشارة لعملية الاكتشاف. نظراً للقدرة الإنتاجية العالية لتحليل البروتينات وانخفاض حدود الإشارة المطلوبة للكشف، تم تطوير طرق تحقُّق ذات خطوة واحدة والتي تستطيع أن تحدث بصورة أسرع مع تقليل استخدام المستهلكات. وهذا يتطلب جسم مضاد ملتقط الذي يتعرف على البروتين المطلوب ويحتوي على علامات اكتشاف/التقاط، وغالباً ما يكون هناك ملتقطات للبروتينات المؤشرة Protein tags. يتم احتضان الملتقط الأولي مع الغشاء بطريقة مشابهة للجسم المضاد الأولي في طريقة الخطوتين، ومن ثم يكون جاهز للكشف بعد سلسلة من خطوات الغسل. لطخة ويسترن باستخدام طريقة الاكتشاف المشع
التحليل
بعد أن يتم غسل الملتقطات الغير ملتصقة، تصبح لطخة ويسترن جاهزة للاكتشاف عن طريق الملتقطات الملتصقة بالبروتين المراد اكتشاف وجوده أو عدمه. في المصطلحات العملية، لا تُظهر كل لطخات ويسترن البروتين بصورة حزمة واحدة فقط على الغشاء.
يتم أخذ تقديرات الحجم عن طريق مقارنة الحزم المكتشفة بحزم الدرج المصبوغة التي تم تحميلها عند خطوة الفصل الكهربائي. يتم إعادة هذه العملية لبروتين هيكلي، مثل الأكتين أو التيوبيولين، الذي لا يجب تغيير تركيزه بين العينات. كمية البروتين الموجودة تتم مقارنتها بالبروتين الهيكلي لكي يتم السيطرة على المجموعات العدة. هذه الطريقة تؤكد تصحيح التغييرات الدارجة بسبب عدم انتقال البروتين أو وجود أخطاء في التجربة. الاكتشاف اللوني Colorimetric detection
طريقة الاكتشاف اللوني تعتمد على احتضان لطخة ويسترن مع المادة التي ستتفاعل مع الإنزيم المراسل (مثل البيروكسيداز Peroxidase) الذي يكون مرتبط بالجسم المضاد الثانوي. هذا يحول الصبغة الذائبة إلى شكل غير ذائب بلون مختلف والتي تترسب قرب الإنزيم وبالتالي تصبغ غشاء النيتروسيليلوز. يتم إيقاف تحميض اللطخة عندها عن طريق غسل الصبغة الذائبة. يتم تحليل كمية البروتينات باستخدام قياس الكثافة densitometry (أي ما هي كثافة البقعة/الصبغة) أو قياس الضوء spectrophotometry. الإضاءة الكيميائية Chemiluminescence
تعتمد طريقة الاكتشاف بالإضاءة الكيميائية على احتضان لطخة ويسترن مع المادة التي تضيء عندما تتصل بالجزيء المراسل على الجسم المضاد الثانوي. وعندها يتم التقاط الضوء باستخدام فيلم فوتوغرافي، ومؤخراً باستخدام كاميرات سي سي دي CCD cameras تلتقط صورة رقمية للطخة ويسترن. هذه الصورة يتم تحليلها باستخدام مقياس الكثافة الذي يحلل كمية الصبغة البروتينية النسبية ويقوم بالتحليل الكمي عن طريق الكثافة الضوئية. يوجد برامج جديدة تساعد على تحليلات البيانات بصورة أخرى مثل تحليل الوزن الجزيئي إذا تم استخدام مقاييس صحيحة. يعتبر ما يسمى بالمضيء الكيميائي المحسن Enhanced chemiluminscent أو ECL هو من ضمن أكثر الطرق حساسية للاكتشاف التحليلي للطخة ويسترن.
الاكتشاف المشع Radioactive detection
العلامات المشعة لا تحتاج إلى مواد إنزيمية، ولكن فقط وضع أفلام أشعة سينية طبية مباشرة على لطخة ويسترن والذي يقوم بخلق أجزاء غامقة على الفيلم تعود إلى حزم البروتينات المطلوب كشفها (انظر الصورة). قلت أهمية طرق الاكتشاف المشع، بسبب كونها مكلفة، ولها أخطار صحية عالية، كما أن المضيء الكيميائي المحسن ECL يعتبر بدل مفيد جداً. الاكتشاف الفلوري Fluorescent detection
يتم تحفيز الملتقط ذو العلامات الفلورية بواسطة الضوء والانبعاث من التحفيز وبذلك يتم الاستدلال عليه بواسطة متحسس ضوئي مثل كاميرا سي سي دي المزودة بمرشح باعث مناسب حيث يقوم بألتقاط الصورة الرقمية للطخة ويسترن ويقوم بالسماح لتحليل بيانات أخرى كالوزن الجزيئي والتحليل الكمي للطخة ويسترن. يعتبر الملتقط الفلوري من بين أكثر الطُرق حساسية لتحليل اللطخة. التحقق الثانوي
أحد الاختلافات الكبيرة بين غشائي النيتروسيليلوز وPVDF يعود إلى قابلية كل منهم على القيام بـ«تعرية» للأجسام المضادة وإعادة الاستخدام لأجسام مضادة ملتقطة لاحقاً. وبالرغم من أن هناك طرق مختبرة لتعرية أغشية النيتروسيليلوز، تظل أغشية الـPVDF أسهل تعرية، وتسهل استخدام أكثر قبل أن يقوم التشويش الخلفي بإعاقة التجارب. أحد الاختلافات الأخرى هو، بعكس النيتروسيليلوز، الـPVDF يجب أن ينقع في 95% إيثانول، بروبانول أو ميثانول قبل الاستخدام. أغشية الـPVDF أيضاً تكون أكثر سمكاً وأكثر مقاومة للضرر خلال الاستخدام.
شرح مبسط
في التقنيات الحيوية، لطخة ويسترن (بالإنجليزية: Western Blot) (تعرف أيضا باللطخة المناعية Immunoblot) هي طريقة اكتشاف بروتين معين في عينة أو مستخلص أنسجة، وهي من التقنيات الحيوية المخبرية. تستخدم الفصل الكهربائي للهلام لفصل البروتينات الطبيعية native proteins أو البروتينات المُتَمَسِّخة denatured proteins حسب طول السلاسل البروتينية (ظروف مفككة) أو حسب الشكل الثلاثي الأبعاد للبروتين (ظروف قومية/غير مفككة). يتم، في ما بعد، نقل البروتينات إلى غشاء (عادة ما يكون الغشاء مصنوعا من مادة النيتروسيليلوز أو ثنائي فلوريد متعدد الفينيليدين)، حيث يتم التحقق (الاكتشاف) باستخدام أضداد مخصصة للبروتين الهدف. هناك الآن العديد من شركات المواد التي تتخصص في تجهيز أضداد (مستنسخة ومتعددة النسائل) ضد آلاف البروتينات المختلفة. وقد قام هذا بتقليل الوقت الذي تحتاجه لعمل لطخة بصورة كبيرة.
شاركنا رأيك
التعليقات
لم يعلق احد حتى الآن .. كن اول من يعلق بالضغط هنا
أقسام شبكة بحوث وتقارير ومعلومات عملت لخدمة الزائر ليسهل عليه تصفح الموقع بسلاسة وأخذ المعلومات تصفح هذا الموضوع [ تعرٌف على ] لطخة ويسترن # اخر تحديث اليوم 2024-03-28 ويمكنك مراسلتنا في حال الملاحظات او التعديل او الإضافة او طلب حذف الموضوع ...آخر تعديل اليوم 10/11/2023