تم النشر اليوم 2024/06/06 | تحليل دورة الخلية

اختبار نيوكليتي

اختبار نيوكليتي (Nicoletty Assay), والذي سمي باسم مخترعه الإيطالي الفيزيائي الدو نيوكليتي (Ildo Nicoletty), هو صورة معدلة عن عملية تحليل دورة حياة الخلية، والذي يقيس عدد الخلايا المستميتة (في عملية الموت المبرمج أو الاستماتة) ويتم ذلك من خلال قياس ما يسمى ب (خلايا G0/G1 الثانوية) والتي تحتوي على كمية اقل من الكروموسومات التي من المفترض تواجدها داخل الخلية في مرحلتي G0 و G1 (يجب ان تكون الكروموسومات في هذه المراحل مضاعفة 2N), مثل هذه الخلايا يمكن ان تنتج من خلال تحطيم الحمض النووي (DNA) بواسطة محطمات الحمض النووي (DNase) خلال عملية الاستماتة بالتالي تكون نواة الخلية تحتوي على اقل من الكمية المفترض تواجدها من الكوروموسومات، مما سسيؤدي إلى حدوث قفزة في الرسم البياني الخاص بالخلايا المصبوغة المضيئة بالتالي يحدد عدد الخلايا المستميتة. تم تطوير هذه الطريقة من خلال نيكوليتي ومساعديه في كلية الطب بجامعة بيروجيا. من الجدير بالذكر ان الجزيئات التي يتم قياسها من ضمن القفزة التي سبق ذكرها والتي تحتوي على اقل من 5% من كمية الحمض النووي المفروض تواجدها في خلايا G1 و G0 الثانوية تعتبر اجسام مسستميتة وليست خلايا مستميتة.

خطوات عملية تحليل دورة الخلية

في حالة تم الصببغ باستخدام صبغة غير هوشست33342 (Hoechst 33342) فيجب اولا جعل الغشاء البلازمي للخلايا قابل للنفاذ ويتم ذلك من خلال وضعها في محلول يحافظ على درجة الرقم الهيدروجيني ويحتوي على منظف مخفف مثل تريتون اكس 100 (TRITON-X100)أو ان بي 40 (NP 40), أو من خلال تثبيت الخلايا في الايثانول، اغلب الصبغات باستثناء هوشست333422 (Hoechst 33342)غير قابلة للنفاذ من خلال الغشاء البلازمي بالتالي تعتبر الخطوة السابقة ضرورية للنجاح الخطوة التي تليها، وهي صبغ الخلايا. قبل أو خلال عملية الصبغ يتم معالجة الخلية بمحطمات للحمض النووي الريبي (RNase) للتخلص منه لان الصبغات ستصبغه كما ستصبغ الحمض النووي وبالتالي ستؤثر على النتيجة، الا في حالة استخدام صبغة الاكريدين البرتقالية لانها ستعطي الحمض النووي الريبي (RNA) اضاءة حمراء والحمض النووي (DNA) اضاءة خضراء، وفي حالة تم ازالة الحمض النووي الريبي (RNA) وتحطمت بعض اجزاء الحمض النووي (DNA) فانه سيصبغ الحمض النووي ثنائي الشريط (الغير محطم) بصبغة مختلفة عن الحمض النووي احادي الشريط (المحطم).و لان الخلايا تميل إلى الالتصاق ببعضها البعض يجب التخلص من الخلايا المتجمعة واستثناءها من عملية التحليل، لان الخلايا من مرحلة G0 و G1 لهما نفس كمية الحمض النووي والتي ستكون مجتمعة مساوية لكمية الحمض النووي الموجودة في خلية من مرحلة S أو M باتالي تعطي قراءة خاطئة.

شرح مبسط

تحليل دورة الخلية من خلال قياس محتوى الحمض النووي هي طريقة تستخدم التدفق الخلوي لتمييز الخلايا في المراحل المختلفة من دورة حياة الخلايا. قبل عملية التحليل، يتم جعل الخلايا قابلة للنفاذ ويتم معالجتها بصبغة فلورية مضيئة والتي تقوم بصباغة الحمض النووي (دي ان ايه DNA)، ومن الامثلة على هذه الصبغات يوديد البوربيديوم (بي آي PI). كثافة الإضاءة في الخلايا المصبوغة تتناسب مع كمية الحمض النووي DNA التي تحتويه طرديا، محتوى الحمض النووي في الخلية يحدد المرحلة اللتي تمر بها الخلية (G0 ,G1, S, G2, M). تنقسم المراحل السابقة إلى جزأين الأول يشمل (G0, G1, S) والثاني يشمل (G2, M) ويتضاعف محتوى الحمض النووي (DNA)في مرحلة S..و يمثل محتوى الحمض النووي (DNA)غالبا على رسم بياني ليقدم معلومات من خلال الترددات التي رسمت لكل مرحلة من مراحل دورة الخلية.